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          TRIzol提取細胞RNA的經(jīng)驗分享

          發(fā)布時(shí)間: 2024-03-26  點(diǎn)擊次數: 284次

          一、TRIzol法提取RNA的原理

          Trizol是一種廣泛適用于多種樣品總RNA提取的試劑,例如人、動(dòng)物、植物和細菌、血液等。一般提取的總RNA沒(méi)有DNA和蛋白質(zhì)污染,常用于RT-qPCR、mRNA純化等實(shí)驗。


          廣譜型Trizol含有異硫氰酸胍/酚,具有裂解能力,可在短時(shí)間內裂解細胞和組織樣本并有效抑制RNase酶活性從而保證RNA的完整性。其原理是Trizol中異硫氰酸胍、苯酚等不可逆地使蛋白質(zhì)和RNase變性。隨后進(jìn)行離心。在酸性條件下,總RNA保留在上層水相中,而大部分DNA和蛋白質(zhì)保留在中間相或下層有機相中。然后通過(guò)用異丙醇沉淀回收總RNA。


          在這個(gè)過(guò)程中,可利用吡咯碳酸二乙酯(DEPC)可滅活RNase酶,75%的酒精洗滌RNA沉淀,去除蛋白質(zhì),相關(guān)有機物的污染;最后用無(wú)核酶水溶解白色沉淀得到所需RNA。值得注意的是TRizol有毒,需在通風(fēng)櫥內操作,做好自我防護??!


          二、實(shí)驗步驟
          以細胞6孔板為例:

          通常情況下,6孔板一般種100萬(wàn)/孔細胞左右,對于TRIZOL法而言,該細胞數目已經(jīng)足夠,但對于新手而言,該數目提取的RNA濃度可能較低,因此我一般做濃度梯度或者時(shí)間梯度實(shí)為了保證RNA足夠后續實(shí)驗要求,因此我會(huì )再6孔板里面鋪200萬(wàn)/孔細胞或者用6cm的中皿鋪300萬(wàn)細胞。
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          圖1. 六孔板(孔內細胞經(jīng)過(guò)處理,渾濁程度不同)
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          圖2. 6cm培養皿

          (1)對于細胞鋪板:一般情況下我會(huì )收集10cm的皿4個(gè)或者5個(gè)T25培養瓶,一般情況下細胞生長(cháng)較好可能會(huì )有3000-4000萬(wàn)的細胞,多的有5000萬(wàn)(懸浮細胞)。以懸浮細胞為例,漿細胞收集至15ml離心管后,離心去上清,再用1-2ml新鮮培養基重懸細胞,通常會(huì )用1ml重懸。根據傳統的細胞計數板估計細胞數目:


          ①將計數板和蓋玻片擦干凈,通常用酒精噴洗幾次,將蓋玻片蓋在計數板上

          ②此時(shí)我們會(huì )對細胞重懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)话阆♂?0-20倍(20ul細胞懸液+180細胞培養基/20ul+380ul)

          ③計數板四個(gè)大方格細胞總數,壓線(xiàn)細胞計左不計右,按照公式:細胞數/ml:4個(gè)大格子細胞總數/4 ×稀釋倍數
          例如:細胞重懸為2ml,稀釋20倍,鋪6孔板,每孔大約200萬(wàn)個(gè)細胞則:四個(gè)大方格計數分別為36,38,39,48,則平均數為40.25,細胞數目為40.25×20×10^4即大約有805萬(wàn)個(gè)細胞/ml。
          鋪6孔板大約需要1200萬(wàn)個(gè)細胞/2ml,則將取樣誤差計算在內:1200/805≈1.5,最終取1.51ml=1510ul細胞加新鮮培養基至12.1ml,驗證:(1.51×805)/12.1≈100萬(wàn)細胞左右,每孔取2ml。

          (2)言歸正傳,目前使用RNA裂解液(TRIZOL)提取RNA:需要自備無(wú)核酶水(DEPC水),異丙醇,氯仿(目前一般用氯仿替代物),無(wú)水乙醇。主要注意事項是:保證無(wú)酶環(huán)境,在通風(fēng)櫥內操作!
          1)貼壁細胞:先用PBS清洗細胞1~2次,六孔板對照組和實(shí)驗組內各加1mlRNA裂解液或0.5ml覆蓋細胞,吹打細胞使其裂解,并將細胞+RNA提取液轉移至1.5mlEP管中(無(wú)酶),做好標記,室溫靜置5min左右;

          2) 向上述裂解液中加入1/5RNA裂解液體積的氯仿200ul(1ml)/100ul(0.5ml),蓋緊管蓋,劇烈振蕩15s左右,使兩者充分混合,呈現乳濁狀(RNA裂解呈粉紅色),室溫靜置5min。
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          3)12000×g 4℃離心15min,樣品分層:上層無(wú)色液體,中間層乳白絮狀沉淀(盡量不要吸取到,可能會(huì )導致基因組DNA的污染),下層粉紅色有機相,小心吸取上層無(wú)色液體至新的無(wú)酶EP管中,通常情況下,取小于RNA裂解液體積的60%約為500ul/200ul。
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          4)在新的EP管中加入等體積的異丙醇,上下顛倒混勻,室溫放置10min;
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          5)2000×g 4℃離心10min,去上清,出現白色膠狀沉淀即RNA;

          6)現配現用75%的乙醇(15ml離心管:11.25ml無(wú)水乙醇+3.75mlDEPC水/無(wú)RNase-free水),加入1.5ml離心管中,輕輕將沉淀彈起洗滌沉淀,7500g× 4℃。一般洗兩次。

          7)室溫晾干5min左右,一般沒(méi)有被揮發(fā)的液體為無(wú)核酶水。最后加入30-50ul(一般加入30ul),溶解沉淀。放置-80保存以供后續使用。
          三、注意事項
          1、上述步驟為常規提取RNA的步驟,前提是我們的細胞量足夠,否則整個(gè)過(guò)程可能就非??简灐靶拍罡?(很可能在異丙醇沉淀RNA這一步驟未有白色沉淀出現):

          (1)做過(guò):6孔板每孔鋪100萬(wàn)細胞,3孔并提最終RNA濃度可達1000多ng/ul,目前200萬(wàn)每孔RNA濃度穩定在300-500ng/ul(六孔板細胞鋪板數目有限);

          (2)步驟3)中吸取水相時(shí),盡可能大小移液槍交替使用,例如取500ul,可使用200ul、100ul、50ul等體積多次吸取,盡量不要吸取到中間的絮狀沉淀。

          2、異丙醇沉淀RNA這一步很關(guān)鍵,在我們離心后吸取丟棄上清時(shí),在這一步之前我們有必要記住離心管放置的位置,例如離心管蓋子方向統一朝外,根據離心方向,我們可以有選擇吸棄上清,如下圖所示。
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          圖3. 離心管擺放位置
          3、值得注意的是75%的酒精現配現用,濃度過(guò)低洗滌不佳,還會(huì )導致RNA溶解,事實(shí)上第二次洗滌沉淀時(shí)我們也可以使用100%酒精,離心轉速7500×g或不更換轉速12000×g也可,洗滌次數不能偷懶,洗滌不干凈可能會(huì )造成后期RNA濃度測定時(shí)蛋白質(zhì)污染。

          4、室溫晾干RNA沉淀時(shí),可以倒扣離心管在濾紙上或者放在通風(fēng)櫥內,放置時(shí)間不宜過(guò)長(cháng),時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致RNA不易溶解。

          5、最后,在異丙醇沉淀RNA這一步驟中,如果看不見(jiàn)沉淀或者看不清沉淀,一種方法是我們可以使用手機手電筒或者mini小手電照射離心管管壁,可能會(huì )有微小的白色附著(zhù)物,或者如第3點(diǎn)中所說(shuō)的記住離心管的擺放位置,大小移液槍更換小心吸棄異丙醇。之后按步驟來(lái)可能仍會(huì )提出RNA。

          6、另外,TRIZOL法提取RNA可將細胞收集至離心管中即步驟(1)完成后,可將含細胞的RNA裂解液于-80冰箱保存保存月余。

          7、通常為了節約試劑,減少用量,0.5ml的TRIZOL足夠RNA的提取。


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