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          GC-1 spg細胞的培養流程及注意事項

          發(fā)布時(shí)間: 2024-03-25  點(diǎn)擊次數: 207次

          一、介紹

          小鼠精原細胞(GC-1 spg)為貼壁細胞,細胞形態(tài)呈上皮細胞樣。

          圖片


          二、主要耗材、儀器及試劑

          15ml離心管、50ml離心管、凍存管、巴氏滴管、培養瓶、封口膜、CO2培養箱、離心機、顯微鏡、生物安全柜、DMEM、胎牛血清(FBS)、PBS緩沖液、青-鏈霉素(雙抗)、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)等等。

          三、培養流程

          1. 細胞復蘇

          1)擦拭生物安全柜臺面,準備好所需耗材,紫外30min,打開(kāi)37℃恒溫水浴箱預熱所用試劑;

          2)按照DMEM+10% FBS+1% P/S的比例配制血清培養基,吹打混勻后按10倍細胞的體積分裝至15ml離心管中;

          3)從液氮中取出GC-1 spg細胞,在水浴箱中快速晃動(dòng)使其融化;

          4)將細胞懸液轉移至提前分裝有血清培養基的離心管中,吹打混勻;

          5)1200rpm,離心3min;

          6)棄去廢液,向離心管中重新加入新的培養基,重懸GC-1 spg細胞沉淀,并轉移至培養瓶中進(jìn)行培養。

          2. 細胞傳代

          1)細胞密度超過(guò)80%即可進(jìn)行傳代,拿出細胞,棄去舊培養液;

          2)用PBS沖洗細胞2-3次(動(dòng)作要輕柔,清洗時(shí)可搖晃培養瓶以保證清洗效果);

          3)棄去廢液,向培養瓶中加入事先預熱好的胰蛋白酶(用量要足以覆蓋細胞層),輕輕晃動(dòng)培養瓶以利于消化;

          4)1min左右后在顯微鏡下觀(guān)察細胞,當90%細胞被消化下來(lái)時(shí),向培養瓶中加入2-3ml的血清培養基,終止消化;

          5)收集細胞懸液至15ml離心管中,1200rpm,離心3min;

          6)等待離心過(guò)程中,可提前在新的培養瓶中加好完培(如T25培養瓶可先加4ml完培);

          7)棄去廢液,用2ml的完培重懸細胞后分裝至新的培養瓶中;

          8)蓋上培養瓶蓋子,以劃“十字"的方式晃動(dòng)培養瓶,以使細胞分布均勻,置于37℃,5%-10%CO2培養箱中進(jìn)行培養。

          3. 細胞凍存

          1)從培養箱中取出培養瓶,棄去舊的培養液,用PBS清洗2-3次;

          2)加入預熱的胰蛋白酶消化細胞,鏡下觀(guān)察消化后加入2-3ml完培終止消化;

          3)收集細胞懸液至15ml離心管中,1200rpm,離心3min;

          4)等待離心過(guò)程中,按照55% DMEM+40%FBS+5%DMSO的比例配制凍存液;

          5)離心結束后,棄去上清,向離心管中加入凍存液,重懸細胞,分裝至凍存管中;

          6)將凍存管放入程序降溫盒中(“慢凍"),置于-80℃冰箱中,第二天即可拿出細胞置于液氮罐中保存。

          四、注意事項

          1.培養細胞所用的培養基及血清等試劑最好沿用之前的,切忌頻繁更換;

          2.棄去舊的培養液時(shí)最好不要直接倒掉,以免瓶口有殘留造成污染;

          3.用胰酶消化細胞時(shí),可輕輕晃動(dòng)培養瓶,并在顯微鏡下觀(guān)察,細胞間隙變大,輕晃培養瓶細胞可自然流下時(shí)即可終止消化,切忌劇烈拍打培養瓶;

          4.對于難消化的細胞可以分兩次進(jìn)行消化,以防胰酶消化時(shí)間過(guò)長(cháng)對細胞造成損傷;

          5.一定要分清細胞培養瓶的正反面。

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