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    冷胰蛋白酶解離組織

    發(fā)布時(shí)間: 2022-12-09  點(diǎn)擊次數: 998次

    原理

    剪碎的組織放在胰蛋白酶中于4°C 放置16~18h ,去除胰蛋白酶后溫育并于溫培養基中分散細胞。

    材料與儀器

    組織 DBSS 粗制胰蛋白酶
    生長(cháng)培養基 皮氏平皿
    培養瓶 鑷子 移液管 錐形瓶 剪刀 冰浴

    步驟

    1. 將組織(1~5 g,預先稱(chēng)重)移入加有新配制的無(wú)菌 DBSS 的皮氏培養皿中,清洗。

    2. 轉入另一培養皿中,切除多余組織如脂肪和壞死組織。

    3. 轉入第三個(gè)培養皿中,用交叉的手術(shù)刀細切成大約 3 mm3 的小塊。胚胎的器官若小于 3 mm3 ,可全部保留。

    4. 用彎鑷子將組織塊移入一個(gè)預稱(chēng)重的 15 ml 或 50 ml 無(wú)菌離心管內。

    5. 讓組織塊沉降。

    6. 用 DBSS 重懸清洗組織塊,沉降后去除上清,重復此步驟兩次以上。

    7. 小心去除剩余液體,預先稱(chēng)重。

    8. 每克組織加入 10 ml 溶于 RPMI1640 或 S-MEM 的 0.25 % 胰蛋白酶(0.25 粗制胰蛋白酶溶于無(wú)血清的 RPMI1640或 MEM/Stirrer salt (S~MEM ) 中),置于 4°C 。

    9. 4°C 放置 6~18 h 。

    10. 小心吸去胰蛋白酶,余下組織及殘余胰蛋白酶(若需要,此時(shí)可加人 1~2 ml 其他酶,如膠原酶、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶等)。

    11. 37°C 放置 20~30 min 。

    12. 加入溫培養基,大約每 100 mg 初始的組織加 1 ml,輕輕上下吸打混合物至組織完-全分散開(kāi)。

    13. 若部分組織未分散,細胞懸液可用無(wú)菌的平紋紗布或不銹鋼篩(100~200 μm ),或一次性使用的塑料篩濾網(wǎng)過(guò)濾細胞,或者讓大的組織塊沉降。當有較多組織時(shí),可于每克組織中多加入 20 ml 培養基促進(jìn)沉淀和隨后的懸液收集,通常 2~3 min 就足以去除大多數的大塊組織。

    14. 用血球計數板或電子計數儀測定懸液的細胞密度,檢査活細胞比率。

    15. 細胞群體為異源性,由于校準口徑較困難,因而初次使用電子計數儀時(shí),需要用血球計數板來(lái)確認。

    16. 將細胞懸液生長(cháng)培養基(生長(cháng)培養基(如DMEM/F12,含10% 胎牛血清))稀釋?zhuān)姑亢辽囵B基含有 1×106 個(gè)細胞。按照需求接種于多個(gè)培養瓶(25 cm2、75cm2 培養瓶)中,大約每平方厘米為 2×105 個(gè)細胞。當存活率不明確或難以預知時(shí),細胞計數便無(wú)價(jià)值(如腫瘤活檢時(shí),死亡細胞的比例很高)。在這種情況下,建議按每毫升 5~25 mg 組織的濃度接種。

    17. 間隔一定時(shí)間更換一次培養基(2~4 天,以 pH 下降為標準)。由于部分細胞黏附較慢甚至易于懸浮生長(cháng),所以丟棄上清前要先檢査上清液中是否有存活的細胞。

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